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正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，研究表明，機體95％以上的活性氧（ROS）都來自于線粒體，其失衡所致的氧化應激與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程有關(guān)。

正常情況下，細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細胞內(nèi)活性氧水平過多，就可破壞線粒體酶類、脂類和核酸，使機體出現(xiàn)氧化應激，同時，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。

因此，通過檢測活性氧的變化來判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴散通過線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計了利用熒光法直接定量檢測線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強度隨時間變化的數(shù)據(jù)點擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。

組成：

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6 ml試劑二充分溶解；

試劑七：液體×1瓶, -20℃避光保存；臨用前用試劑二稀釋300倍后使用；

自備儀器和用品：

多功能酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

線粒體提取：

1、準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將上述勻漿液于600g（離心率），4℃離心5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、棄上清，沉淀中加入200μl試劑二重懸。

測定步驟：

1、 多功能酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)激發(fā)光499nm，發(fā)射光521nm。

2. 在黑色不透光96孔板中加入下列試劑

孵育完成后，在37℃恒溫下測定10min內(nèi)熒光強度，激發(fā)波長499nm，發(fā)射波長521nm，記錄10min內(nèi)的熒光值變化。

ROS產(chǎn)生速率計算：

對采樣數(shù)據(jù)點即熒光強度隨時間的變化進行線性回歸擬合處理 ,計算出回歸系數(shù),即直線斜率（k）。實際線粒體ROS產(chǎn)生速率等于樣本熒光強度隨時間變化的數(shù)據(jù)點線性回歸直線斜率(k測定)減去本底熒光強度隨時間變的數(shù)據(jù)點線性回歸直線斜率（k空白）。

(1)按樣本鮮重計算：每g組織線粒體每秒鐘熒光單位的變化,即u/ s/g 鮮重    

ROS產(chǎn)生速率(u/ s/g鮮重)=(k測定-k空白)/(V樣÷V總×W）=10×(k測定-k空白)÷W

(2)按樣本蛋白濃度計算：每毫克蛋白線粒體每秒鐘熒光單位的變化u/ s/mg prot。

ROS產(chǎn)生速率(u/ s/ mg prot)=(k測定-k空白)/(V樣÷V總×Cpr）=10×(k測定-k空白)÷Cpr

V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：懸液體積，0.2 ml；W: 樣本鮮重，g；Cpr: 樣本蛋白濃度，mg/ml。