α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）檢測試劑盒（分光光度法50T/48S）
| 貨號 | SH0230 | 售價（元） | 888 |
| 規(guī)格 | 50T/48S | CAS號 |
- 產品簡介
- 相關產品
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0230 |
α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）檢測試劑盒（分光光度法50T/48S） |
50管/48樣 |
測定意義：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調控關鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。
測定原理：
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
組成：
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產品名稱 |
SH0230-50T/48S |
Storage |
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試劑一：液體 |
50ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
10ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
55.5ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1支 |
4℃ |
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試劑六：粉劑 |
1支 |
4℃ |
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試劑七：粉劑 |
1支 |
4℃ |
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試劑八：粉劑 |
1支 |
4℃ |
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試劑九：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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試劑十：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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說明書 |
一份 |
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試劑十：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2.1ml蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體α-KGDH活性測定。
測定步驟：
1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm處，蒸餾水調零。
2、工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。
3、在1ml石英比色皿中依次加入40μl試劑十、60μl樣本和1.1ml工作液，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和2min20s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
α-KGDH活性計算：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA
V反總：反應體系總體積，1.2×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。