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線粒體異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒(微量法100T/96S)

貨號 SH0237 售價(元) 1260
規(guī)格 100T/96S CAS號
  • 產(chǎn)品簡介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

SH0237

線粒體異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒(微量法100T/96S)

100管/96樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義:

ICDHmEC 1.1.1.41)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸,同時將NAD+ 還原為NADH,是三羧酸循環(huán)的限速酶之一,其催化的反應(yīng)是細胞NADH主要來源之一。

測定原理:

ICDHm催化NAD+ 還原生成NADH,導(dǎo)致340nm處光吸收上升。

組成:

產(chǎn)品名稱

SH0237-100T/96S

Storage

試劑一:液體

100ml

-20℃

試劑二:液體

20ml

-20℃

試劑三:液體

1.5ml

-20℃

試劑四:液體

20ml

4℃

試劑五:粉劑

1

4℃

試劑六:粉劑

1

-20℃

說明書

一份

自備儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1ml試劑一和10μl 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g4℃離心5min。

3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的ICDHm(此步可選做)。

5、 在步驟的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體ICDHm活性測定。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

1)在試劑五中加入18ml試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

2)在試劑六中加入1ml蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、10μl試劑六和180μl試劑五,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A12min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1

ICDHm活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

 ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

 ICDHmnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=0.65×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應(yīng)時間,2minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mlW:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

 ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

 ICDHmnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=650×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

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