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線粒體異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒（微量法100T/96S）
| 貨號 | SH0237 | 售價（元） | 1260 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0237 |
線粒體異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒（微量法100T/96S） |
100管/96樣 |
測定意義：
ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，同時將NAD+ 還原為NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應(yīng)是細胞NADH主要來源之一。
測定原理：
ICDHm催化NAD+ 還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0237-100T/96S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
20ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1.5ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
20ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1支 |
4℃ |
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試劑六：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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說明書 |
一份 |
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自備儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的ICDHm（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體ICDHm活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）在試劑五中加入18ml試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）在試劑六中加入1ml蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、10μl試劑六和180μl試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.65×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=650×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。