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線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S）
| 貨號(hào) | SH0246 | 售價(jià)（元） | 816 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0246 |
線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）檢測(cè)試劑盒（微量法 100T/96S） |
100管/96樣 |
測(cè)定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。
測(cè)定原理：
MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0246-100T/96S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
20ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1.5ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
20 ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1瓶 |
-20℃ |
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說(shuō)明書 |
一份 |
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自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿液于600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的MDH（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于MDHm活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑五中加入19ml試劑四和0.5ml蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
3、測(cè)定前將檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μl樣本和195μl工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
MDHm活力單位的計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =1299×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=0.65×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =2598×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=1.3×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬(wàn)。