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測定意義：

果糖-1,6二磷酸酶又稱果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機(jī)磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。

測定原理：

FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算FBP活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入20ml試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑二：液體7.2μl×1支，4℃保存；臨用前加入1ml蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入1ml蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理

①總FBP酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體FBP酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿FBP酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中FBP酶活性。

建議測定總FBP酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FBP，則按照步驟②提取粗酶液。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑一、二、三37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘

3、 加樣表：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中，立即混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，在340 nm波長下記錄反應(yīng)1min后吸光度A1和反應(yīng)6min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

FBP活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。