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1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)檢測(cè)試劑盒(分光光度法50T/48S)

貨號(hào) SH0518 售價(jià)(元) 4560
規(guī)格 50T/48S CAS號(hào)
  • 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)

名稱(chēng)

規(guī)格

SH0518

1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)檢測(cè)試劑盒(分光光度法50T/48S) 

50T/48S

SH0519

1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)檢測(cè)試劑盒(分光光度法25T/24S) 

25T/24S

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義:

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶,既控制著CO2的固定,同時(shí)又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。

測(cè)定原理:

1)在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO2結(jié)合,產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA);(2PGA可通過(guò)外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸,伴隨著NADH氧化生成NAD+;(3)在340 nm NADH有特征吸收峰,而NAD+沒(méi)有此吸收峰,因此測(cè)定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。

組成:

產(chǎn)品名稱(chēng)

SH0519-25T/24S

SH0518-50T/48S

Storage

提取液液體

25ml

50ml

4℃

提取液液體

25ml

50ml

4℃

試劑一:液體

30ml                                 

60ml

4℃

試劑二:粉劑

1

1

-20

試劑三:粉劑

1

1

-20

試劑:粉劑

1

1

-20℃

說(shuō)明書(shū)

一份

 

SH0519-25T/24S試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入12.5ml試劑一,充分混勻待用;用不完的SH0519-25T/24S試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

SH0519-25T/24S試劑三:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入12.5ml試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

SH0519-25T/24S試劑四:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入1.25 ml試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

SH0518-50T/48S試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入25ml試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

SH0518-50T/48S試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入25ml試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

SH0518-50T/48S試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入2.5 ml試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

(注意:試劑二、三、四溶解后,按需分裝-20℃保存。)

自備儀器和用品:

可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液制備:

Rubisco酶提?。?/span>建議稱(chēng)取約0.1g樣本,加入1ml提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃8000g離心10min,取上清測(cè)定。

胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml)1510的比例(建議稱(chēng)取約0.1g樣本,加入1ml提取液一),冰浴勻漿后于4℃,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4℃,8000g離心10min,取上清用于測(cè)定胞漿Rubisco酶活性,取沉淀加1ml提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃,8000g離心10min取上清測(cè)定葉綠體中Rubisco酶活性。

建議測(cè)定總Rubisco酶活性,按照步驟提取粗酶液,若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的Rubisco,則按步驟提取粗酶液。

(照注意:粗酶液制備過(guò)程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。)

測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定

(1) 工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三11混合,用多少配多少;

(2) 1ml石英比色皿中加入50ul樣本、50ul試劑四和900ul工作液,混勻,立即記錄340nm20s時(shí)吸光值A15min20s時(shí)的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

Rubisco活性計(jì)算:

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:25℃1 mg蛋白1 min氧化1 n mol NADH。

 Rubisconmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購(gòu)本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:25℃1 g組織1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisconmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V÷V樣總×W) ÷T=643×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義:

V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.05 ml;V樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;W:樣本質(zhì)量,g。

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