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馬英新團(tuán)隊(duì)開發(fā)RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng),用于快速靈敏檢測(cè)非洲豬瘟

       非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止,仍然沒有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應(yīng)對(duì)非洲豬瘟,通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對(duì)疫情進(jìn)行有效控制。

      目前,對(duì)于非洲豬瘟的診斷主要依賴于PCR技術(shù),該技術(shù)依賴于儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員,只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,無法滿足現(xiàn)場(chǎng)診斷的需求。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),如重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等,具有高效、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)勢(shì),但其靈敏度有限,難以單獨(dú)用于分子診斷。通過與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)用,靈敏度顯著提高,可增加分子診斷的準(zhǔn)確性。然而,目前常用的單模式熒光檢測(cè)法或比色檢測(cè)法易受到環(huán)境干擾,造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

2023年5月11日,中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所馬英新課題組與湖北大學(xué)印文博士合作,在 Analytical Chemistry 期刊上發(fā)表了題為:Fluorescence and Colorimetric Analysis of African Swine Fever VirusBased on RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Strategy 的補(bǔ)充封面論文。

該論文首次構(gòu)建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)非洲豬瘟病毒ASFV)比色-熒光雙模式檢測(cè)策略,通過構(gòu)建新型磁珠-酶報(bào)告系統(tǒng),結(jié)合RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測(cè)。

該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)單拷貝病毒基因組檢測(cè),可用于便攜式可視化診斷,且在臨床樣本應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的檢測(cè)性能,為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有力工具。

 

 

超高靈敏CRISPR-Cas12a分子診斷傳感器構(gòu)建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查

      本研究開發(fā)了一種結(jié)合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報(bào)告系統(tǒng),用于ASFV基因的快速精準(zhǔn)診斷的方法。如圖1所示,biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶(ALP)通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成biotin-ssDNA-ALP,biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠(SA-MB)結(jié)合獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告系統(tǒng)。用RPA擴(kuò)增ASFV基因序列,獲得擴(kuò)增子,擴(kuò)增子與Cas12a-crRNA復(fù)合物結(jié)合,激活Cas12a反式切割活性,切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA,釋放ALP;ALP催化pNPP水解生成pNP,引起比色信號(hào)變化,再加入量子點(diǎn)作為熒光報(bào)告子,實(shí)現(xiàn)比色和熒光的雙模式信號(hào)輸出。

 

1:探針構(gòu)建及ASFV檢測(cè)原理圖。

      biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)獲得biotin-ssDNA-ALP,biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯(lián)獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告子。RPA擴(kuò)增ASFV基因,擴(kuò)增子激活Cas12a-crRNA復(fù)合物,Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報(bào)告子,釋放ALP;ALP水解pNPP,生成黃色pNP,加入藍(lán)色QDs后,在內(nèi)濾效應(yīng)作用下,藍(lán)色QDs熒光被猝滅。

在該研究中,團(tuán)隊(duì)首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP,并驗(yàn)證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯(lián)以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后,考察了RPA擴(kuò)增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)了三對(duì)RPA引物,通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三對(duì)引物都可高效擴(kuò)增ASFV基因。接著,驗(yàn)證了CRISPR-Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設(shè)計(jì)靶向三個(gè)RPA擴(kuò)增子序列的crRNA,利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了Cas12a被激活并切割RPA擴(kuò)增子。最后,結(jié)合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)以及藍(lán)色CdZnSe QDs,實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測(cè),靈敏度達(dá)20 copies/mL,可視化檢測(cè)104 copies/mL(圖 2A-2D)。

      磁分離技術(shù)的使用可有效降低背景信號(hào),實(shí)現(xiàn)高信噪比檢測(cè)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)本研究開發(fā)的檢測(cè)方法靈敏度高于qPCR,且具有良好的特異性,探針不與其它豬疾病相關(guān)病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同時(shí),還探究了該方法在實(shí)際樣本中的檢測(cè)能力,對(duì)12份豬血真實(shí)樣本進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示該檢測(cè)方法具有100%的準(zhǔn)確度(圖2E和2F)。本方法結(jié)合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性,具有良好的靈敏度、便攜性和特異性,為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有效工具。

 

2 比色-熒光雙模式檢測(cè)ASFV基因。(A)不同濃度ASFV基因下,pNP的紫外光譜。(B)400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。(C)不同濃度ASFV基因下,CdZnSe QDs的熒光光譜。(D)熒光強(qiáng)度變化與ASFV基因濃度的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系。比色(E)和熒光(F)檢測(cè)方法用于臨床樣本的分析結(jié)果。可視化檢測(cè)結(jié)果均列于圖片上方。

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32104-01

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100 pmol

32104-03

1000 pmol

32116-01

AacCas12b(C2c1)

100 pmol

32116-03

1000 pmol

32106-01

FnCas12a(Cpf1)

100 pmol

32106-03

1000 pmol

32110-01

Lb5Cas12a(Cpf1)

100 pmol

32110-03

1000 pmol

32101-01

SpCas9

100 pmol

32101-03

1000 pmol

32102-01

Sp-dCas9

100 pmol

32102-03

1000 pmol

 

貨號(hào)

產(chǎn)品

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JY0209

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