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雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

貨號 FBK001 售價(元) 856
規(guī)格 100T CAS號
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產(chǎn)品簡介:

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

價格

FBK001

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

100T

 856

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是先以螢光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase),后以腸腔素(coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase),并且在后續(xù)加入海腎螢光素酶底物時,同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化luciferin發(fā)光的物質(zhì),使后續(xù)檢測僅僅檢測到海腎螢光素酶的活性,實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。
螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過程中,會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide,在coelenterazine氧化的過程中也會發(fā)出生物螢光。生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進(jìn)行測定。本試劑盒的檢測原理參考圖1.

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒為檢測基因的表達(dá)量提供有效的手段,在DLR?檢測中,螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)和海腎螢光素酶(Renilla luciferase)的活性可在單個樣品中依次檢測。先以螢光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶的活性,然后加入抑制螢火蟲螢光素酶催化的物質(zhì),同時加入腔腸素(Coelenterazine)檢測海腎螢光素酶的活性,實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。通過螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系,可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或?5'?啟動子區(qū)克隆在Luciferase?的上游,或把3'-UTR?區(qū)克隆在Luciferase?的下游,構(gòu)建成報告基因(Reporter gene)質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞,通過檢測螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參,以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。

螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為560nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為465nm。

本試劑盒的光信號可以通過化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測定儀進(jìn)行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣,無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點。

Figure 1. Bioluminescent reactions catalyzed by firefly luciferase??and Renilla luciferase.

試劑盒組份:

Cat No

Product Name

Size

Price

FBK001

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

100T

856

Cat No

Components

Quantity

Storage

FBK001-A

1X Passive Luciferase Lysis Buffer

10ml

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-B

Firefly Luciferase Assay Buffer

10ml

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-C

D-Luciferin

2mg

-80°C Protect from light??1 year

FBK001-D

Renilla Luciferase Assay Buffer

10mL

-20°C Protect from light??1 year

FBK001-E

Coelenterazine

400ug

-80°C Protect from light??1 year

保存條件:

最好在-80℃保存。將?C?組分溶解到?B?組分后,該混合液不可反復(fù)凍融,建議進(jìn)行小批量分裝,并于-20℃(最長可儲存?1?個月)或-80℃(最長可儲存?1?年)條件下儲存。Renilla Luciferase Assay solution(D+E)應(yīng)新鮮配制,當(dāng)天使用。

使用方法:

1. 裂解細(xì)胞:

將報告基因細(xì)胞裂解液充分混勻后,按如下方式加入報告基因細(xì)胞裂解液,充分裂解細(xì)胞。

1.1)對于貼壁細(xì)胞:吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后,參考下表加入適量的報告基因細(xì)胞裂解液;對于懸浮細(xì)胞:離心去上清后,參考下表加入適量報告基因細(xì)胞裂解液。

Cell Culture Plate

96-well?plates

48-well?plates

24-well?plates

12-well?plates

6-well?plates

Lysis Buffer?(A) uL/per well

20uL

65uL

100uL

250uL

500uL

注:裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h,-70℃可長期存放(裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融);

注:如果螢光素酶的表達(dá)水平比較低,可以嘗試使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以最小為100微升。
      1.2)?充分裂解后,10,000-15,000g離心3-5分鐘,取上清用于測定。
注:細(xì)胞裂解后可以立即測定螢光素酶,也可以先凍存,待以后再測定。凍存樣品需融解,并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。

2. Preparation of Firefly Working Solution

2.1)?將所有組分恢復(fù)至室溫。

2.2)?配置10 mg/mL D-luciferin儲存液。2mg組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以儲存6個月反復(fù)凍融5次。

2.3)工作液配置 :用組分?B?按照1:50稀釋以上D-luciferin儲存液,配制成?0.2 mg/mL?的螢火蟲螢光素酶工作液。

注:螢火蟲螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融超過5次,若單次實驗用量較少,建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

3. Preparation of Renilla Working Solution

3.1)??將所有組分恢復(fù)至室溫。

3.2)?配置2 mg/mL Coelenterazine儲存液。400ug組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以儲存3個月反復(fù)凍融5次。

3.3)工作液配置 :用組分?D?按照1:50稀釋以上coelenterazine儲存液,配制成?0.04 mg/mL?的1x?coelenterazine工作液。

注:1×Coelenterazine工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,配置后在3小時內(nèi)使用。

4. 化學(xué)發(fā)光值檢測

4.1)按儀器操作說明書開啟具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的儀器如酶標(biāo)儀。

4.2)每個樣品測定時,取樣品?20-100uL(如果樣品量足夠,請加入?100 μL;如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量,但檢測孔用量需保持一致)。1× Lysis Buffer?為空白對照。

4.3)加入?100uL螢火蟲螢光素酶檢測液,用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定?RLU(relative light unit)值。

注:由于該發(fā)光為瞬時發(fā)光,建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后,立即進(jìn)行檢測。

4.4)加入?100uL 1× Coelenterazine?工作液,用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定?RLU(relative light unit)值。

4.5)在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下,用螢火蟲螢光素酶測定得到的?RLU?值除以海腎螢光素酶測定得到的?RLU?值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參,也可以進(jìn)行類似計算。

注意事項:

1)為取得最佳測定效果,在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時, 樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制一致;使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時,宜先把樣品全部加好,然后統(tǒng)一加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

2)?由于溫度對酶反應(yīng)有影響,所以測定時,樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。

3?本公司所有產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于生命科學(xué)研究,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅。

4)?本公司所有產(chǎn)品必須由合格專業(yè)技術(shù)人員操作同時佩戴口罩/手套/實驗服并遵守生物實驗室安全操作規(guī)程!