
當(dāng)前位置: 首頁 - 產(chǎn)品目錄 - 細(xì)胞增殖與毒性

超氧化物歧化酶SOD活性檢測試劑盒(WST-1法)
貨號(hào) | FBK002 | 售價(jià)(元) | 795 |
規(guī)格 | 100T | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品簡介
貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
價(jià)格 |
FBK002 |
超氧化物歧化酶SOD活性檢測試劑盒(WST-1法) |
100T |
795 |
超氧化歧化酶(SOD)能夠催化超氧陰離子(O2?-)歧化,生成過生成過氧化氫(H2O2)和單質(zhì)氧氣(O2),是一種重要的抗氧化酶。目前有許多間接或者直接測定SOD的方法,其中,其中NBT(氮藍(lán)四唑)法由于使用方便而被廣泛使用,但是,NBT法有幾個(gè)缺點(diǎn),例如生成的染料水溶性差,而且會(huì)和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應(yīng)。雖然cytochrome C法也常被用來做SOD檢測,但它和超氧化物反應(yīng)過于劇烈,不能測定低水平的SOD。SOD Assay Kit-WST-1使用了易溶于水的噻唑鹽:WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氫-四唑鹽,二鈉鹽),能夠和超氧陰離子反應(yīng)生成水溶性的染料,因此可以簡便地進(jìn)行SOD的檢測。WST-1與超氧陰離子反應(yīng)的劇烈程度比cytochrome C小70倍;因此,它的檢測靈敏度非常高,并且能夠通過將樣品用buffer稀釋,使背景的吸光度最小化。WST-1不會(huì)和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應(yīng),因此,能夠檢測SOD100%的抑制率。WST-1被超氧陰離子還原的比率與黃嘌呤氧化酶的活性線性相關(guān),并且會(huì)被SOD所抑制(見下圖)。因此,SOD或者SOD類似物的IC50(50%的抑制濃度)就能用比色法來測定。
圖1. 基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系和WST-1的SOD酶活力檢測原理圖。XO:xanthine oxidase。
目前測定SOD比較先進(jìn)的方法包括WST-1法和WST-8法,其中WST-8法比WST-1法更加穩(wěn)定、靈敏度更高。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中穩(wěn)定性和靈敏度較好的WST-1法。
WST-1的反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物,可以通過單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度檢測來測定SOD活力,適合高通量篩選研究。同時(shí)WST-1法測定SOD酶活力時(shí),最大抑制百分率可以接近100%,并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾,使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的性能優(yōu)于同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)。本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)相同,等量SOD導(dǎo)致的吸光度變化值顯著大于NBT法,線性范圍更寬。本試劑盒提供的SOD樣品制備液能直接裂解細(xì)胞,無需勻漿,操作更加便捷。
本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細(xì)胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫,會(huì)干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法,能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如,對于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測,標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達(dá)0.1mM的過氧化氫時(shí),對于檢測結(jié)果仍無顯著影響。本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清(漿)、胸水、腹水、腎透析液、尿液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、心肌培養(yǎng)細(xì)胞、腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)植物組織細(xì)胞級亞細(xì)胞等生物樣品中的SOD活力。
試劑盒組份:
產(chǎn)品編號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
價(jià)格 |
FBK002-100T |
總SOD活性檢測試劑盒(~WST-1法) |
100次 |
795元 |
產(chǎn)品組分編號(hào) |
產(chǎn)品組份名稱 |
包裝 |
保存 |
FBK002-1 |
SOD樣品制備液 |
50mL |
-20°C避光1年 |
FBK002-2 |
SOD檢測緩沖液 |
50ml |
|
FBK002-3 |
WST-1 |
0.8mL |
|
FBK002-4 |
酶溶液 |
0.1ml |
|
FBK002-5 |
反應(yīng)啟動(dòng)液(40X) |
0.06ml |
|
注意事項(xiàng):
1)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)所用的稀釋液應(yīng)盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品也宜使用SOD樣品制備液進(jìn)行稀釋;當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時(shí),宜使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2)酶溶液有時(shí)會(huì)被分成兩層,因此忽略移液器混合步驟會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
3)為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,建議每個(gè)樣品進(jìn)行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)。
4)本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
5)為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用方法:
1.樣品的準(zhǔn)備:
a) 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
對于貼壁細(xì)胞,吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液,用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍,按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入本試劑盒提供的SOD樣品制備液,適當(dāng)吹打以充分裂解細(xì)胞;對于懸浮細(xì)胞,600g離心5分鐘收集細(xì)胞,用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍,按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入SOD樣品制備液,適當(dāng)吹打,以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000g離心3-5分鐘,取上清作為待測樣品。
b) 組織樣品的準(zhǔn)備:
動(dòng)物用生理鹽水(0.9% NaCl,含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品,按照每10mg組織加入100微升SOD樣品制備液的比例在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動(dòng)勻漿器)。4℃約12,000g離心3-5分鐘,取上清作為待測樣品。
c) 血漿或紅細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
用抗凝管收集血液,顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘,移取上清至另一新的1ml離心管中,適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟1a 懸浮細(xì)胞樣品的制備方法,或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d) 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大,該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。
e) 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量,用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如,小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為1:10)上清,通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定,可以冰浴保存;如果當(dāng)天不能完成測定,可以-70℃凍存,但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作:
a) WST-1/酶工作液的配制:按照每個(gè)反應(yīng)160μl的體積配制適量的WST-1/酶工作液。均勻混合151μl SOD檢測緩沖液、8uL WST-1和1ul酶溶液,即可配制成160μl WST-1/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量,配制適量的WST-1/酶工作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-1/酶工作液4℃或冰浴保存,可以在當(dāng)天使用,但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意:由于酶溶液的用量較少且易沉降,必須注意在使用前先輕輕離心一下,然后適當(dāng)混勻后再使用。
待測樣品數(shù)量
1
10
20
50
SOD檢測緩沖液(uL)
151
1510
3020
7550
WST-1(uL)
8
80
160
400
酶溶液(uL)
1
10
20
50
WST-1/酶工作液(uL)
160
1600
3200
8000
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
b) 反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制:把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)融解后混勻,按照每1μl反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)加入39μl SOD檢測緩沖液的比例進(jìn)行稀釋,混勻后即為反應(yīng)啟動(dòng)工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量,配制適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存,可以在當(dāng)天使用,但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
樣品(Sample)/標(biāo)準(zhǔn)品
空白對照1(Blank1)
空白對照2(Blank2)
空白對照3 (Blank3)*
待測樣品
20μl
-
-
20μl
SOD檢測緩沖液
-
20μl
40μl
20μl
WST-1/酶工作液
160μl
160μl
160μl
160μl
反應(yīng)啟動(dòng)工作液
20μl
20μl
-
-
c) (可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備:需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品,用本試劑盒提供的SOD樣品制備液(當(dāng)樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí))或SOD檢測緩沖液(當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時(shí))將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度:100U/ml,50U/ml,20U/ml,10U/ml,5U/ml,2U/ml,1U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升,參考樣品進(jìn)行檢測。SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果參考圖2。說明:為避免稀釋后SOD酶活性的下降,SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用;本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品,但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
3.樣品測定:
a) 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意:加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開始,可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì),則需設(shè)置空白對照3;如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。
b) 37℃孵育30分鐘。說明:孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異,但為保證檢測結(jié)果的一致性,推薦孵育30分鐘。
c) 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片,可以使用420-480nm的濾光片??梢赃x擇設(shè)定600nm (或600nm以上,如650nm)作為參比波長(也稱參考波長),450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長的吸光度讀數(shù)即可作為實(shí)測讀數(shù)。
4.樣品中總SOD活力的計(jì)算:
a) 抑制百分率的計(jì)算:
參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率:
抑制百分率=[(A空白對照1-A空白對照2)-(A樣品-A空白對照3)]/(A空白對照1-A空白對照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物,則A空白對照2 = A空白對照3,此時(shí)可以把計(jì)算公式簡化 為如下形式(簡化時(shí)可以不設(shè)置空白對照3):
抑制百分率 = (A空白對照1-A樣品) / (A空白對照1-A空白對照2) × 100%
如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需適當(dāng)稀釋樣品;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品。
b) SOD酶活力單位的定義:在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí),反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。注意:SOD的活力單位的定義方式有很多種,不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。
c) SOD酶活力的計(jì)算:
圖2. 本試劑盒對SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果。圖A縱坐標(biāo)ΔA450為孵育30分鐘后,空白對照1與SOD標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA450及抑制百分率(圖B)呈非線性關(guān)系,而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關(guān)系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考,實(shí)際測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能會(huì)因具體反應(yīng)條件的不同和上圖有較明顯的差別。
SOD酶活力的計(jì)算公式如下:
待測樣品中SOD酶活力單位=檢測體系中SOD酶活力單位=抑制百分率/(1-抑制百分率)units
例如,當(dāng)抑制百分率為50%時(shí),待測樣品中SOD酶活力單位=50% / (1-50%)units=1 unit;當(dāng)抑制百分率為60%時(shí),待測樣品中SOD酶活力單位=60% / (1-60%)units=1.5 units。
d.如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液,可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù),將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液,可以根據(jù)血紅蛋白含量,可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1:SOD酶活力計(jì)算的參考方案:可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線,然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考,使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測和計(jì)算。此外,本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠,不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。
附2:SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測:如果條件許可,使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時(shí)在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率:
抑制百分率=[(斜率空白對照1-斜率空白對照2)-(斜率樣品-斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1-斜率空白對照2)×100%
其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測和計(jì)算更加精確一些,但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。