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轉(zhuǎn)氫酶-1檢測(cè)試劑盒(微量法 100T/96S)

貨號(hào) SH0263 售價(jià)(元) 1980
規(guī)格 100T/96S CAS號(hào)
  • 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
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貨號(hào)

名稱

規(guī)格

SH0263

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-1(TH-1)試劑盒微量法 100T/96S)

100管/96樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義:

TH位于線粒體的內(nèi)膜上,又稱為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六,催化NADH+NADP+ NAD++NADPH相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱為TH-1。線粒體NADH含量增加時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的H+電化學(xué)梯度升高,因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上ROS的產(chǎn)生。TH-1促進(jìn)NADH轉(zhuǎn)換為NADPH,從而提高線粒體的抗氧化能力。

測(cè)定原理:

NADHNADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代NADP+,TH-1催化 APADP+還原生成的APADPH375nm有特征光吸收,因此通過測(cè)定375nm光吸收增加速率,來計(jì)算TH-1活性。

試劑的組成和配制:

產(chǎn)品名稱

SH0263-100T/96S

Storage

試劑一:液體

100ml

-20

試劑二:液體

50ml

-20

試劑三:液體

18ml

4

試劑:粉劑

1

-20

試劑五:粉劑

1

-20

說明書

一份

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g,4℃離心5min

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的TH-1(此步可選做)。

5、步驟4中的沉淀即為線粒體,加入500uL試劑二,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于TH-1活性測(cè)定。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至375nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

1)工作液的配制:臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,混勻,立即記錄375nm處初始吸光值A110min后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。

TH-1活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εAPADPH摩爾消光系數(shù),6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mLT:反應(yīng)時(shí)間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH-1活性(nmol/min /104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεAPADPH摩爾消光系數(shù),6.7×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

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