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轉(zhuǎn)氫酶-2檢測試劑盒(分光光度法50T/48S)

貨號 SH0264 售價(元) 1560
規(guī)格 50T/48S CAS號
  • 產(chǎn)品簡介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號

名稱

規(guī)格

SH0264

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2(TH-2)試劑盒(分光光度法50T/48S)

50管/48樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義:

TH位于線粒體的內(nèi)膜上,又稱為線粒體復合體六,催化NADH+NADP+NAD++NADPH相互轉(zhuǎn)化,調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2,催化NADPHNAD+生成NADP+NADH。

測定原理:

NADHNADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+還原生成APADH,APADH375nm有特征光吸收,測定375nm光吸收的增加速率,來計算TH-2活性。

試劑的組成和配制:

產(chǎn)品名稱

SH0264-50T/48S

Storage

試劑一:液體

50ml

-20

試劑二:液體

25ml

-20

試劑三:液體

25ml×2

4

試劑:粉劑

2

-20

試劑五:粉劑

2

-20

說明書

一份

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞,加入1mL試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g,4℃離心5min

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的TH-2(此步可選做)。

5、步驟4中的沉淀即為線粒體,加入500uL試劑二,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于TH-2活性測定。

測定步驟:

1、 分光光度計預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至375nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

1)工作液的配制:臨用前取試劑三、試劑四和試劑五各一支,將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

2)在1mL玻璃比色皿中加入100μL樣本和1000μL工作液,混勻,立即記錄375nm處初始吸光值A110min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

TH-2活性計算

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。

 TH-2活性(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。

TH-2活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=82×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。

TH-2活性(nmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.164×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,1.1×10-3L;εAPADH摩爾消光系數(shù),6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

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