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葉綠體復(fù)合體Ⅴ檢測(cè)試劑盒(分光光度法25T/12S)

貨號(hào) SH0268 售價(jià)(元) 1584
規(guī)格 25T/12S CAS號(hào)
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  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)

名稱(chēng)

規(guī)格

SH0268

葉綠體復(fù)合體Ⅴ檢測(cè)試劑盒(分光光度法25T/12S)

25管/12樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義:

葉綠體復(fù)合體又稱(chēng)F1F0-ATP合酶,由F1F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過(guò)程水解ATP。復(fù)合體是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理:

復(fù)合體水解ATP產(chǎn)生ADPPi,通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體活性。

組成:

產(chǎn)品名稱(chēng)

SH0268-25T/12S

Storage

試劑一:液體

25ml

-20

試劑二:粉劑

1

-20

試劑三:液體

6ml

4℃

試劑:粉劑

1

4℃

試劑五:粉劑

1

4℃

試劑粉劑

1

4℃

試劑:液體

10ml

室溫

說(shuō)明書(shū)

一份

 

試劑二:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入1.3ml蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3ml蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑五:粉劑×1, 4℃保存;臨用前加入10ml蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑六:粉劑×1, 4℃保存;臨用前加入10ml蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

定磷試劑的配制:按H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請(qǐng)根據(jù)需要,用多少配多少);

注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

需自備儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

葉綠體的提取:

1、稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1ml試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿,很快研磨或搗碎,30秒內(nèi)完成,使之成為勻漿液。

2、將勻漿液于200g(離心率),4℃離心1min。

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,1500g4℃離心5min。

4、棄上清液,于沉淀中加入0.5ml試劑一混勻配成葉綠體懸浮液。混勻后測(cè)定葉綠體酶活性。

測(cè)定步驟:

1、酶促反應(yīng)

試劑名稱(chēng)(μl

對(duì)照管

測(cè)定管

試劑二

25

25

試劑三

100

100

 樣本

 

125

混勻, 37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴30min

試劑四

50

50

樣本

125

 

混勻,4000g25℃離心10min,取上清液

2、定磷

上清液

170

170

定磷試劑

830

830

混勻,室溫靜置10min左右,在660nm處讀取A測(cè)定管和A對(duì)照管,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

復(fù)合體活性計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),yA值。

組織中復(fù)合體活性的計(jì)算:

1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體活性(nmol/min/mg prot=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V×Cpr) ÷T

                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V÷V樣總) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體活性(nmol/min /104 cell=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)

V反總:反應(yīng)體系總體積,3×10-4 L; V樣:加入樣本體積,0.125 ml;V樣總:加入提取液體積,0.5 mlT:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mlW:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

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