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葉綠體復(fù)合體Ⅴ檢測試劑盒（微量法100T/48S）
| 貨號 | SH0269 | 售價（元） | 3120 |
| 規(guī)格 | 100T/48S | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0269 |
葉綠體復(fù)合體Ⅴ檢測試劑盒（微量法100T/48S） |
100管/48樣 |
測定意義：
葉綠體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測定原理：
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
試劑的組成和配制：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0269-100T/48S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
8ml |
4℃ |
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試劑四：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑六：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
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試劑七：液體 |
10ml |
室溫 |
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說明書 |
一份 |
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試劑二：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2ml蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4ml蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10ml蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑六：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10ml蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
葉綠體的提取：
1、稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿，很快研磨或搗碎，30秒內(nèi)完成，使之成為勻漿液。
2、將勻漿液于200g（離心率），4℃離心1min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，1500g，4℃離心5min。
4、棄上清液，于沉淀中加入0.5ml試劑一混勻配成葉綠體懸浮液?；靹蚝鬁y定葉綠體酶活性。
測定步驟：
1、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）
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試劑名稱（μl） |
對照管 |
測定管 |
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試劑二 |
10 |
10 |
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試劑三 |
40 |
40 |
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樣本 |
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50 |
混勻， 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴30min：
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試劑四 |
20 |
20 |
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樣本 |
50 |
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混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）
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上清液 |
30 |
30 |
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定磷試劑 |
170 |
170 |
混勻，室溫靜置10min后，在 660nm處讀取A測定管和A對照管，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。
復(fù)合體Ⅴ活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為A值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)
V反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10-4 L； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，0.5 ml；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.637x + 0.004；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為A值。
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=62.74× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.126× (ΔA-0.004)
V反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10-4 L； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，0.5 ml；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。