近年來(lái),以CRISPR/Cas為代表的基因編輯帶來(lái)了生物技術(shù)革命性的進(jìn)步,分別在2015和2017年兩次被Science評(píng)為年度突破性科學(xué)進(jìn)展之首,獲評(píng)Nature近10年最具影響力的五大科學(xué)事件之首和2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。短短幾年時(shí)間,CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門內(nèi)容,被稱為下一代分子診斷技術(shù)!
CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹:
1987年,CRISPR 位點(diǎn)在細(xì)菌基因組中被發(fā)現(xiàn),2002年CRISPR相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn),隨后證實(shí)CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),可以抵御病毒、質(zhì)粒等入侵遺傳元素,其免疫過(guò)程大致可以分為三個(gè)階段:適應(yīng)、表達(dá)和干擾。
(1)適應(yīng)階段Cas蛋白識(shí)別并捕獲外來(lái)核酸片段,獲取新間隔序列,并整合插入自身CRISPR陣列,形成免疫記憶。
(2)表達(dá)階段當(dāng)外來(lái)核酸再次入侵時(shí),從CRISPR陣列中相對(duì)應(yīng)的間隔序列,轉(zhuǎn)錄出CRISPRRNA(crRNA)前體并加工獲得小的、成熟的crRNA,其中包含一個(gè)保守的重復(fù)序列和一個(gè)間隔序列,crRNA進(jìn)一步與一個(gè)或多個(gè)Cas蛋白相互作用,形成RN(ribonucleoprotein)復(fù)合體。
(3)干擾階段Cas-crRNA復(fù)合體識(shí)別外來(lái)核酸,通過(guò)crRNA靶向目標(biāo)核酸區(qū)域,介導(dǎo)Cas蛋白特異性地破壞入侵核酸。
CRISPR/Cas可分為二大類群:第1類以多個(gè)Cas組成的效應(yīng)復(fù)合體行使功能為特征,包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型;第2類則只需單個(gè)多結(jié)構(gòu)域的Cas,包括Ⅱ(Cas9)、Ⅴ(Cas12)和Ⅵ(Cas13)型。第2類系統(tǒng)簡(jiǎn)單、高效、操作方便,是目前主要的基因編輯系統(tǒng),其中最具代表性的是Cas9。
Cas9編輯基因原理
相比Cas9,Cas12a和Cas13a僅需crRNA 即可實(shí)現(xiàn)特異性靶位點(diǎn)切割,這表明其系統(tǒng)更為簡(jiǎn)潔,具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力。
基于Cas12a的分子檢測(cè)系統(tǒng):
廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)的三種Cas12a蛋白包括LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a,其中LbCas12a的反式切割活性最強(qiáng)。2017年Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)檢測(cè)技術(shù),利用LbCas12a(Lachnospiraceae bacterium ND2006)與crRNA復(fù)合物,并在crRNA引導(dǎo)下利用RuvC結(jié)構(gòu)域切割PAM(TTTN)序列下游18~25nt的靶DNA,在識(shí)別并切割靶標(biāo)dsDNA的同時(shí),激發(fā)Cas12a的反式切割活性,切割反應(yīng)體系中的ssDNA報(bào)告分子。ssDNA報(bào)告分子標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán),一旦切割,熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)被分離,就會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定而強(qiáng)烈的熒光信號(hào),熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以指示檢 測(cè)樣本中靶標(biāo)的量。此外,DETECTR還與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合(recombinase polymerase amplification,RPA),不僅提高了檢測(cè)分析的靈敏度(amol/L水平),而且避免了對(duì)復(fù)雜、昂貴設(shè)備的需求。該技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)和SARS-CoV-2的檢測(cè)。
DETECTR檢測(cè)方法原理圖
2018年王金、趙國(guó)屏團(tuán)隊(duì)建立了HOLMES(one-hour lowcost multipurpose highly efficient system)檢測(cè)技術(shù),聯(lián)合LbCas12a與PCR擴(kuò)增,可以在1 h內(nèi)完成對(duì)偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的檢測(cè),靈敏度可以達(dá)到1~10 amol/L,此外還可以準(zhǔn)確區(qū)分病毒基因型以及人類的單核苷酸多態(tài)性 。但是,該技術(shù)聯(lián)合PCR擴(kuò)增提高穩(wěn)定性的同時(shí)也增加了檢測(cè)時(shí)間和設(shè)備依賴性。
基于Cas12b的分子檢測(cè)系統(tǒng):
來(lái)源于嗜熱菌的Cas12b含有單個(gè)RuvC結(jié)構(gòu)域,脫靶效應(yīng)低且同樣具有反式切割活性。CRISPRCas12b是雙RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng),可以識(shí)別和切割靶向dsDNA或ssDNA,也可以非特異性切割ssDNA。當(dāng)靶向dsDNA時(shí),Cas12b依靠PAM序列(TTC或TAC)完成順式切割。當(dāng)靶向ssDNA時(shí),Cas12b可不依賴PAM序列實(shí)現(xiàn)切割,而且切割活性高于dsDNA。
根據(jù)這些特性,王金、趙國(guó)屏團(tuán)隊(duì)建立了升級(jí)版的HOLMESv2,將AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris)蛋白與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)結(jié)合,只有含有5?-TTC-3?的dsDNA或切割后具有的5?-TAC-3?的DNA序列才能激活A(yù)acCas12b反式切割活性,該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA、RNA特異性檢測(cè)以及區(qū)分SNP和定量DNA甲基化。
2019年,Dai等開(kāi)發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR檢測(cè)技術(shù),通過(guò)CRISPR-Cas系統(tǒng)來(lái)影響電信號(hào)輸出,利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導(dǎo)信號(hào)。該檢測(cè)技術(shù)將修飾有3′-亞甲基藍(lán)(3′-MB)標(biāo)簽的ssDNA報(bào)告分子固定于金電極上,在靶DNA存在的情況下,Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子,亞甲基藍(lán)標(biāo)簽的分離,會(huì)使電化學(xué)信號(hào)降低。在沒(méi)有靶標(biāo)DNA存在時(shí),Cas12a的反式切割活性保持沉默,ssDNA分子保留在電極表面,從而導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的高電化學(xué)電流。
SHERLOCK檢測(cè)方法原理
2020年,Ding等開(kāi)發(fā)了AIOD CRISPR(all-in-one dual CRISPR-Cas12a)檢測(cè)技術(shù),將RPA擴(kuò)增和CRISPR檢測(cè)的所有反應(yīng)組分混合,在引入兩個(gè)crRNA的同時(shí),添加高濃度ssDNA報(bào)告分子,一步即可完成對(duì)SARS-CoV-2和HIV-1的檢測(cè)。
基于Cas13的分子檢測(cè)系統(tǒng):
Cas13是RNA引導(dǎo)和RNA靶向的核酸酶,具有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域,特異性作用于RNA靶標(biāo)。2017年,張峰團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)與DETECTR原理相同,但依賴于LwaCas13a(Leptotirichia wadei)核酸酶的活性,識(shí)別和切割靶標(biāo)RNA的同時(shí),反式切割ssDNA報(bào)告分子產(chǎn)生熒光信號(hào)。
SHERLOCK檢測(cè)方法原理
為了解決定量的問(wèn)題,該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了SHERLOCKv2,將4種類型的Cas蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a)組合使用,切割用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的報(bào)告分子,在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中進(jìn)行檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了定量同時(shí)檢測(cè)4種核酸序列。SHERLOCKv2也被應(yīng)用于側(cè)向流動(dòng)分析,通過(guò)金納米顆粒標(biāo)記的抗FAM抗體,在試紙條上檢測(cè)被切割的報(bào)告分子,產(chǎn)生視覺(jué)比色信號(hào)。
SHERLOCKv2 檢測(cè)結(jié)果讀取方式
2020年,ACKERMAN等聯(lián)合CRISPR診斷和微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)了CARMEN(combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids)檢測(cè)平臺(tái),該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)8個(gè)樣本,169種人類相關(guān)病毒。但由于芯片定制成本高和檢驗(yàn)操作流程復(fù)制,很難應(yīng)用于臨床。該團(tuán)隊(duì)在CARMENv.1的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了mCARMEN(microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids),將CRISPR診斷、微陣列技術(shù)與簡(jiǎn)化的臨床工作流程相結(jié)合,開(kāi)發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測(cè)面板,可同時(shí)檢測(cè)21種呼吸道病毒,包括SARS-CoV-2及其他冠狀病毒、流感病毒等。
CARMEN-Cas13檢測(cè)方法原理
Arizti-Sanz團(tuán)隊(duì)將擴(kuò)增與CRISPR-Cas13系統(tǒng)檢測(cè)整合為一步診斷平臺(tái)SHIN(streamlined highlight of infection to navigate pandemic),通過(guò)添加RNase H提高核酸檢測(cè)靈敏度,并采用管內(nèi)熒光和配套的智能手機(jī)應(yīng)用程序,實(shí)現(xiàn)了SARS-CoV-2有效的核酸檢測(cè)。SHINE診斷平臺(tái)最大限度地減少了對(duì)設(shè)備的要求,也減少了結(jié)果讀數(shù)偏差。
基于Cas14的分子檢測(cè)系統(tǒng):
除了Cas12和Cas13系統(tǒng)外,結(jié)構(gòu)緊湊的Cas14蛋白也具有類似的反式切割活性。Cas14是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶,與CRISPRCas12相比,Cas14識(shí)別和切割目標(biāo)核酸序列不受PAM序列的限制,而且對(duì)crRNA與靶標(biāo)模板之間的核苷酸錯(cuò)配的容忍性更低,內(nèi)部序列對(duì)核苷酸錯(cuò)配更敏感,這一特性使Cas14能夠?qū)崿F(xiàn)高保真的區(qū)分SNP?;诖颂匦越⒌腃as14a-DETECTR檢測(cè)平臺(tái),已應(yīng)用于人類HERC2基因SNP分型。
CRISPR/Cas14a分子檢測(cè)示意圖
CRISPR/Cas技術(shù)優(yōu)勢(shì):
發(fā)展至目前,基于CRISPR的核酸檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)高特異性,可實(shí)現(xiàn)單核苷酸點(diǎn)突變檢測(cè);
(2)高靈敏性,可實(shí)現(xiàn)單拷貝核酸檢測(cè);
(3)快速性,整個(gè)檢測(cè)在0.5–1.0h內(nèi)完成;
(4)簡(jiǎn)便性,不需專業(yè)設(shè)備及人員,可現(xiàn)場(chǎng)完成;
(5)試劑耐受冷凍干燥,便于儲(chǔ)存和攜帶;
(6)易開(kāi)發(fā)性,可快速開(kāi)發(fā)出新核酸檢測(cè)試劑盒等。
隨著進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化,其更具通用性,CRISPR核酸檢測(cè)技術(shù)將成為POCT的最優(yōu)選。
已報(bào)道的多種基于 CRISPR 的分子檢測(cè)技術(shù)比較
CRISPR/Cas未來(lái)方向
第一,是新的Cas蛋白的開(kāi)發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來(lái)發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈DNA,豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測(cè)通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。
第二,是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺(tái)結(jié)合起來(lái),開(kāi)發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管,以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上,從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號(hào)擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號(hào)輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開(kāi)發(fā)出的CARMAN技術(shù),可以對(duì)數(shù)十個(gè)樣本,上百種病毒進(jìn)行快速檢測(cè),為解決通量低的問(wèn)題提供了方法等。
RPA試劑盒及試紙條系列:
貨號(hào) |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
JY0209 |
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型) |
50T |
JY0201 |
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型) |
50T |
JY0307 |
Tiosbio? CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條 |
50T |
JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
JY0308 |
Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條(變色龍) |
50T |
WLB8201KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型) |
48T |
WLE8202KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(熒光型) |
48T |
WLN8203KIT |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(膠體金試紙條型) |
48T |
WLRB8204KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型) |
48T |
WLRE8205KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(熒光型) |
48T |
WLRN8206KIT |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(膠體金試紙條型) |
48T |
WLB5001 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體基礎(chǔ)型) |
100T |
WLN5002 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體膠體金型) |
100T |
WLR5003 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體熒光型) |
100T |
WLRB5001 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體基礎(chǔ)型) |
100T |
WLRN5002 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體膠體金型) |
100T |
WLRE5003 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(液體熒光型) |
100T
|
Cas酶系列
貨號(hào) |
包裝規(guī)格 |
中文名稱 |
32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9(H840A) |
32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9(H840A) |