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CRISPR檢測保姆級攻略

根據(jù)Cas蛋白的組成不同,CRISPR/Cads系統(tǒng)分為兩大類,即ClassⅠ和ClassⅡ。其中ClassⅠ系統(tǒng)的效應復合物由多個Cas蛋白亞基組成,該類別的共同特征是利用多個Cas蛋白效應復合物實現(xiàn)功能;而ClassⅡ系統(tǒng)的效應復合物則是單個多結(jié)構域蛋白,如Cas9、Cas12、Cas13等。由于單個效應蛋白便于操作,因此ClassⅡ類CRISPR/Cas系統(tǒng)在實際應用中更為廣泛。

 

1、Cas酶的選擇

Cas酶在CRISPR檢測中扮演著至關重要的角色,能夠精準地識別并切割與目標序列互補的DNA或RNA,從而實現(xiàn)對特定基因的高效檢測。由于實驗目的、靶標基因、操作條件等差異,選擇合適Cas酶也尤為重要。

Cas12a:又稱Cpf1,它是一種核酸內(nèi)切酶,能特異性識別并剪切帶PAM(5'-TTTN-3'或5'-TTN-3')的雙鏈DNA(dsDNA)靶標,使DNA雙鏈斷裂并生成黏性末端。此外,對單鏈DNA(ssDNA)靶標的識別和剪切不依賴PAM序列。

Cas12b:同樣是一種依賴SgRNA介導的核酸內(nèi)切酶,能特異性識別并剪切帶PAM(5'-TTN-3)的dsDNA,使DNA雙鏈斷裂并生成黏性末端。特別的是,它在45-65°C的中高溫環(huán)境中具備更高的切割活性。

Cas13a:它在SgRNA引導下,可以識別并切割體系中的特異單鏈RNA。在切割特定RNA序列后,其“附屬切割”活性會被激活,可高效地切割體系中的任意序列sSRNA。

Cas13a:它在sgRNA引導下,可以識別并切割體系中的特異單鏈RNA。在切割特定RNA序列后,其“附屬切割”活性會被激活,可高效地切割體系中的任意序列sSRNA。

 

2、crRNA設計與合成

crRNA是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一個關鍵組成部分,它識別并引導Cas蛋白到目標核酸序列位置,通過與目標DNA或RNA序列的互補配對,指導Cas蛋白進行精確的切割或編輯。crRNA極大影響檢測體系的靈敏度,因此在實驗中我們需選擇效果最優(yōu)的crRNA。

crRNA設計合成涉及以下注意事項:

1.目標序列選擇:選擇一個特定的目標序列作為設計的起點,通常是根據(jù)目標基因的功能和相關研究的需要來確定,選擇基因組中的高拷貝重復片段作為靶標基因,

2.PAM序列選擇:在目標序列附近選擇適當?shù)腜AM序列。

 

3.避免剪切位點:避免剪切位點與其他非目標基因席列相匹配。這可以通過使用序列比對軟件來實現(xiàn),

4.避免剪切位點的二級結(jié)構:避免目標序列和其他非目標序列形成穩(wěn)定的二級結(jié)構。

5.序列選擇與驗證:在設計過程中,可以使用序列比對工具和結(jié)構預測工具來評估設計的crRNA的特異性和有效性,最后通過實驗證實設計的crRNA的特異性和剪切效果。

以下是我們常用的crRNA引物設計序列:

1.LbCas12a:

5'AAUUUCUACUAAGUGUAGAUNNNNNNNN 3’(N表示與特導靶標序列互補配對的spacer區(qū))

2.Aapcas12b:

5'GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNN3',(N表示與特導靶標序列互補配對的spacerx)

3.LwaCas13a:

5'GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUNNNNNN3',(N表示與AAAACNNNN特異靶標序列互補配對的spacer區(qū),建議spacer區(qū)長度為20-28nt)

4.LbuCas13a:

5'GGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACCAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3',(N表示與特異靶標序列互補配對的spacer區(qū))

3、恒溫擴展體系選擇

恒溫擴增技術(Isothermal Amplification)是實現(xiàn)快速、精確檢測的關鍵方法之一。它相比傳統(tǒng)的PCR方法更加簡便和快速,特別是在需要現(xiàn)場快速檢測或設備條件有限的情況下顯示出了其獨特的優(yōu)勢。下面為大家介紹一下常見的恒溫擴增體系。

1. LAMP(環(huán)介導等溫擴增)

特點: LAMP技術依賴于一組特制的引物和Bst DNA聚合酶的特異性裂解活性,能在一個恒定的溫度(通常是60°C-65°C)下進行。這個方法能在短時間內(nèi)(一般小于一個小時)高效地進行擴增,并且可以通過肉眼觀察擴增結(jié)果(如加入熒光劑)。

2. RPA(重組酶聚合酶擴增)

特點: RPA技術在室溫或接近室溫條件(37°C-42°C)下工作,無需特殊設備。RPA通過使用重組酶來解開雙鏈DNA,在較短時間內(nèi)完成目標DNA的擴增。3.NASBA(核酸序列依賴的擴增) 特點:NASBA反應在恒溫條件(41°C-42°C)下進行,擴增的產(chǎn)物可以是單鏈DNA或雙鏈RNA??梢詸z測到較低濃度的RNA靶標,但對試劑的穩(wěn)定性要求較高,且操作相對復雜。

3.NASBA(核酸序列依賴的擴增)

特點:NASBA反應在恒溫條件(41°C-42°C)下進行,擴增的產(chǎn)物可以是單鏈DNA或雙鏈RNA??梢詸z測到較低濃度的RNA靶標,但對試劑的穩(wěn)定性要求較高,且操作相對復雜。

在選擇恒溫擴增體系時,需要綜合考慮多種因素,包括:實驗目的、目標序列特性、實驗條件、以及擴增體系的穩(wěn)定性和效率等。以下是在選擇恒溫擴增體系時考慮的兩大重要因素:

1)目標序列特性:目標序列的長度、GC含量、是否存在二級結(jié)構等因素都會影響到恒溫擴增的效果。因此在選擇恒溫擴增體系時,需要充分了解目標序列的特性,并選擇適合該特性的擴增體系,

2)擴增體系的穩(wěn)定性和效率:恒溫擴增體系的穩(wěn)定性和效率是選擇時需要考慮的重要因素。穩(wěn)定的體系可以減少實驗誤差,提高結(jié)果的準確性;高效的體系可以縮短實驗時間,提高實驗效率.

RISPR/Cas未來方向

第一,是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅長識別單鏈DNA,豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應”提供了方法。

第二,是將CRISPR/Cas其和其他的技術平臺結(jié)合起來,開發(fā)新穎實用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場效應晶體管,以及將Cas系統(tǒng)的報告探針固定于電極上,從而實現(xiàn)不需要使用信號擴增的電化學生物傳感器的構建。使用水凝膠作為其響應原件實現(xiàn)多樣化的信號輸出。與微流體技術結(jié)合開發(fā)出的CARMAN技術,可以對數(shù)十個樣本,上百種病毒進行快速檢測,為解決通量低的問題提供了方法等。

RPA試劑盒及試紙條系列:

貨號

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0201

單靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(彩虹型)

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條(變色龍)

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎型)

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎型)

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型)

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎型)

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體基礎型)

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體膠體金型)

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴增試劑盒(液體熒光型)

100T

 

Cas酶系列

貨號

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9(H840A)

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9(H840A)